بررسی تأثیر برخی ترکیبات فنلی و آنزیم های اکسیداتیو در استقرار ریزنمونه های گردوی ایرانی (juglans regia l.) در شرایط درون شیشه ای
چکیده
این پژوهش در قالب سه آزمایش مستقل و در دو سال متوالی به¬منظور بررسی شرایط بهبود استقرار ریزقلمه گردو (juglans regia l.)، ارقام جمال و چندلر صورت گرفت. در سال اول، تأثیر زمان تهی? ریزقلمه و شرایط محیط کشت بر استقرار ریزقلمه¬های گردو مورد ارزیابی قرار گرفت. در سال دوم، آزمایش¬های دوم و سوم انجام شد. آزمایش دوم در دو بخش انجام شد. در بخش اول، فعالیت آنزیم¬های پراکسیداز و پلی فنل اکسیداز در ریزقلمه و محیط کشت و در بخش دوم تأثیر تیمارهای قبل و پس از کشت بر فعالیت این دو آنزیم در محیط کشت در زمان¬های مختلف پس از کشت ریزقلمه ارقام جمال و چندلر ارزیابی شد. آزمایش سوم در سه بخش انجام شد. در بخش اول، مقادیر برخی ترکیبات فنلی در چهار مرحله مختلف رشد شاخه سال¬جاری و همچنین، برخی ترکیبات فنلی تراوش شده از ریزقلمه تک گره تهیه شده در هر مرحله به محیط کشت مایع (dkw) ارقام جمال و چندلر ارزیابی گردید. در بخش دوم، هم-زمان با کشت در محیط کشت مایع در هر مرحله از رشد شاخه سال¬جاری، از شاخه¬های جمع آوری شده، ریزقلمه تک گره تهیه و در محیط کشت جامد (dkw) کشت شد. در بخش سوم آزمایش، تأثیر ترکیبات فنلی تراوش شده در بخش قبلی این آزمایش در محیط مایع بر استقرار ریزقلمه در محیط کشت جامد بررسی شد. آزمایش اول، در قالب آزمایش فاکتوریل بر اساس طرح کاملاً تصادفی و در آزمایش¬های دوم و سوم، ارزیابی¬های مربوط به ریزقلمه و محیط کشت در فواصل زمانی مشخص و به¬صورت آزمایش اندازه¬های تکرار شده در چارچوب طرح¬های کاملاً تصادفی و بلوک¬های کامل تصادفی انجام شد. هر آزمایش در سه تکرار (هر تکرار 30-20 ریزقلمه/محیط کشت) انجام شد. نتایج آزمایش اول نشان داد که نمونه¬گیری در اردیبهشت ماه اختلاف معنی¬داری با نمونه گیری در تیر و شهریور ماه داشت و کمترین محتوای فنل کل، کمترین شاخص قهوه¬ای شدن و بیشترین استقرار را در شرایط مختلف محیط کشت در مقایسه با ریزقلمه¬های تهیه شده در تیر و شهریور ماه داشتند. نتایج بخش اول آزمایش دوم الگوی تقریباً مشابه¬ای در فعالیت آنزیم¬ها در ریزقلمه و محیط کشت دو رقم نشان داد. هرچند میزان فعالیت آنزیم¬ها در محیط کشت بمراتب کمتر از ریزقلمه بود. نتایج بخش دوم این آزمایش نشان داد در تیمارهای شاهد، غوطه¬وری در پلی واینیل پیرولیدون، اسید آسکوربیک و کشت¬های قرار گرفته در تاریکی در مقایسه با تیمارهای واکشت در ذغال فعال و اسید آسکوربیک فعالیت آنزیم¬ها در زمان کوتاه¬تر و با شیب بیشتری افزایش و سپس کاهش یافت. طبق نتایج بخش اول آزمایش سوم ارقام جمال و چندلر از نظر ترکیبات فنلی بررسی شده، الگوی مشابهی را با استفاده از hplc نشان دادند. ترکیبات کاتچین، روتین، میریستین (فلانوئیدها)، ژوگلون، 1و4 نفتوکوئینون (کوئینون¬ها)، الاژیک اسید، وانیلیک اسید، کوماریک اسید، کلروژنیک اسید، کافئیک اسید، جینتیسک اسید، فرولیک اسید، سیرینژیک اسید و سینامیک اسید (اسیدهای فنلی) در شاخه سال¬جاری و محیط کشت شناسایی شد. مقایس? مستقل گروهی ترکیبات فنلی (مقایسه یک ترکیب خاص با 13 ترکیب دیگر در محیط کشت) در مراحل تهی? ریزقلمه دو رقم نشان داد که زمان نمونه¬گیری از شاخساره سال¬جاری و زمان ارزیابی محیط کشت تأثیر معنی¬داری در سطح یک درصد بر محتوای ترکیبات فنلی دارد. ترکیبات ژوگلون، الاژیک اسید، میریستین و وانیلیک اسید در شاخساره سال¬جاری و محیط کشت به ترتیب بیشترین مقادیر را داشتند و میزان تراوش این ترکیبات در نمونه¬گیری 15 و 31 اردیبهشت ماه کمتر از تیر و شهریور ماه بود. مقادیر این ترکیبات در 24 ساعت اولیه کم و طی 72 و 144 ساعت پس از کشت بتدریج در محیط کشت انباشته شدند. نتایج بخش دوم آزمایش نشان داد محتوای فنل کل در محیط کشت جامد در زمان تهیّ? ریزقلمه در ابتدای فصل رشد نسبت به اواسط و انتهای فصل رشد در حداقل مقدار خود قرار دارد و ریزقلمه¬ها در همین زمان کمترین شاخص قهوه¬ای شدن و بالاترین میزان استقرار را در محیط کشت داشتند. نتایج بخش سوم آزمایش نشان داد که اضافه کردن ترکیبات تراوش شده بعد از 144 ساعت به محیط کشت، بیشترین تأثیر را در کاهش رشد و افزایش شاخص قهوه¬ای شدن ریزقلمه در محیط کشت داشت. از طرف دیگر، اضافه کردن ترکیب ژوگلون به محیط کشت به تنهایی تأثیر کمتری بر کاهش رشد ریزقلمه در مقایسه با اضافه کردن ترکیبات تراوش شده در محیط کشت در 72 و 144 ساعت پس از کشت داشت که نشان می¬دهد احتمالاً ترکیب ژوگلون به تنهایی عامل اصلی بازدارند? رشد و عامل قهوه¬ای شدن ریزقلمه در محیط کشت نباشد و ترکیبی از مواد که در روزهای آغازین پس از کشت ریزقلمه به محیط کشت تراوش می¬شوند با هم اثرگذار بوده و سبب قهوه¬ای شدن ریزقلمه و محیط کشت و در نهایت، عدم استقرار ریزقلمه می¬شود. به¬طور کلی انتخاب صحیح زمان تهی? ریزقلمه از درخت با حداقل محتوای ترکیبات فنلی و همچنین تیمارهایی مانند واکشت در فواصل زمانی کم، اضافه کردن ذغال فعال، اسید آسکوربیک به محیط کشت و قرارگیری کشت¬ها در تاریکی و همچنین انتخاب ارقام مناسب با محتوای فنل درونی کم تا حدود زیادی سبب خواهد شد مقادیر کمتری از ترکیبات فنلی به محیط کشت تراوش شده و یا از دسترس خارج شود. از آنجائی¬که همین ترکیبات فنلی متنوع تراوش شده در محیط کشت، سوبستراهای اصلی آنزیم¬های اکسیداتیو هستند از این¬رو با انتخاب مناسب زمان تهی? ریزقلمه، شرایط محیط کشت و رقم، مقادیر کمتری از ترکیبات فنلی به محیط کشت تراوش شده و از فعالیت آنزیم¬های اکسیداتیو کاسته می-شود. در این شرایط تعداد ریزقلم? کمتری در محیط کشت قهوه¬ای شده و شاخص¬های رشد و استقرار ریزقلمه افزایش خواهد یافت.