بیان ژن بتا دیفنسین 2 نوتروفیل گاو درفضای پری پلاسمی باکتری اشریشیا-کولی و مقایسه با بیان سیتوپلاسمی
چکیده
یکی از ویژگی های سلول های درگیر در دستگاه ایمنی ذاتی تولید انواعی از پپتید های ضد میکروبی کاتیونی با وزن مولکولی6-2 کیلودالتون می باشد. یکی از بزرگترین خانواده ی این پپتید ها دیفنسین ها می باشند که با طیف وسیع فعالیت علیه باکتری ها، ویروس ها، قارچ ها و… به عنوان آنتی بیوتیک های طبیعی محسوب می شوند. هدف از این تحقیق، طراحی و سنتز، بیان پری پلاسمی و سیتوپلاسمی، خالص سازی و نیز بررسی و مقایسه ی خاصیت ضد قارچی پروتئین بتا دیفنسین 2 نوتروفیل گاوی (bnbd2) در دو نوع بیان شده بوده است. در این مطالعه باکتری bl21 حامل وکتور pet48b(+) که در آن ژن bnbd2 همراه با سیگنال پپتید pelb در ابتدای آن، همسانه سازی شده بود، استفاده گردید. بیان در محیط کشت lb و با غلظت 1 میلی مولار iptg در دمای 30 درجه ی سانتیگراد انجام شد. بیان پری پلاسمی بعد از شوک اسمزی و نیز بیان سیتوپلاسمی بعد از سونیکاسیون توسط الکتروفورز عمودی sds-page بررسی گردید. مرحله ی خالص سازی پروتئین نوترکیب با استفاده از کروماتوگرافی تمایلی ستون نیکل انجام و تخلیص پپتید نیز با استفاده از برش شیمیایی و شکافت در جایگاه اسید فرمیک صورت گرفت. اثر ضد قارچی پروتئین تخلیص شده بر روی گونه های آسپرژیلوس و نیز کاندیدا آلبیکنز در دو نوع سیتوپلاسمی و پری پلاسمی بررسی و مقایسه گردید. نتایج آزمایشات sds-page و دات بلات و وسترن بلات، بیان پروتئین نوترکیب و اتصال آن را به آنتی بادیmouse anti-(his)6 peroxidase تایید کرد. همچنین هاله های عدم رشد در محیط کشت مولر-هینتون آگار، خاصیت ضد قارچی پروتئین bnbd2 را با اختلافی کم در دو نوع پری پلاسمی و سیتوپلاسمی نشان داد.