کلونینگ و بیان ژن بتا دیفنسین 2 نوتروفیل گاو در باکتری e. coli
چکیده
سیستم ایمنی موجودات چند سلولی شامل چندین پلی پپتید کاتیونیک با وزن مولکولی کمتر از 10 کیلو دالتون میباشند. در میان پپتیدهای ضد میکروب، دیفنسینها یکی از بزرگترین خانوادهی پپتیدهای ضد میکروب میباشند و به واسطهی فعالیت آنها بر ضد باکتریها، قارچها و بسیاری از ویروسها، به عنوان آنتیبیوتیکهای نسل جدید منفعت بسیار دارند. هدف از این مطالعه طراحی، سنتز، بیان، تخلیص و بررسی خاصیت ضد میکروبی پروتئین bnbd2 بوده است. در این مطالعهی باکتریbl21 حامل وکتور pet-32a(+) که ژن bnbd2 در آن همسانه سازی شده بود استفاده گردید. بیان پروتئین bnbd2 با تغییر در پارامترهای، دمای رشد و غلظت مادهی القا کننده (iptg) با استفاده از سیستم الکتروفورز عمودی (sds-page) بررسی گردید. با استفاده از محیط کشت lb، شروع القا در جذب نوری 8/0 در طول موج 600 نانومتر، غلظت یک میلی مولار مادهی القا کنندهی iptg و دمای رشد 30 درجه بیشترین بیان پروتئین به دست آمد. مراحل تخلیص پروتئین با کمک روش شیمیایی شکافت در جایگاه فرمیک اسید و عبور از سانتریکون انجام گردید و اثر ضد باکتریایی پروتئین تخلیص شده بر باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی بررسی گردید. نتایج آزمایش وسترن بلاتینگ نیز نشان داد که پروتئین نوترکیب به طور اختصاصی به آنتیبادی mouse anti-(his)6 peroxidase متصل میگردد. تشکیل هالهی عدم رشد در محیط کشت مولر هینتون آگار، خاصیت ضد باکتری این پروتئین را نشان میدهد.