تخلیص و تعیین برخی خواص فیزیکوشیمیایی آنزیم گلوتامات دهیدروژناز از باکتری کوماموناس اسیدوارنس
چکیده
گلوتامات دهیدروژناز (gdh) واکنش تبادل 2-اکسوگلوتارات و ال - گلوتامات را کاتالیز می کند. این آنزیم تقریبا درتمام ارگانیسم ها وجود دارد، زیرا نقش مهمی در متابولیسم واسطه ای اسیدهای آمینه و کربوهیدرات ها دارد. بر اساس مطالعه روی باکتریهای خاک، نشان داده شده است که کوماموناس اسیدوارنس که یک باکتری غیربیماری زای خاک است، فعالیت زیادی از gdh را دارد. در این مطالعه این آنزیم از این باکتری بعد از رشد آن در بهترین محیط کشت، استخراج و خواص فیزیکوشیمیائی آن بررسی شد. ال - گلوتامات در محیط کشت افزوده شد تا فعالیت gdh القا گردد. پس از رشد، سلول ها توسط سونیکه شدن خرد شدن و آنزیم از عصاره سلولی توسط رسوب گیری با سولفات آمونیم 35 درصد و بعد 70 درصد، رسوب داده شد. بعد از آن، نمونه توسط روشهای مختلف کروماتوگرافی، از جمله غربالگری ژل روی سفادکس 200-g، کروماتوگرافی تعویض یونی روی -deae سلولز وکروماتوگرافی تمایلی روی پورسیون بلو mx-r خالص شد. پیشرفت مراحل به تعیین جذب نمونه ها در 280 نانومتر و اندازه گیری فعالیت آنزیم، پیگیری شد. فعالیت ویژه آنزیم خالص شده 90/80 واحد بر میلی گرم، مرتبه خالص سازی 34/16 و بازده کار 48/18 درصد بود. همچنین خلوص و وزن مولکولی زیر واحدها آنزیم توسط الکتروفورز روی صفحه -sds تعیین شد. بر طبق این نتایج وزن مولکولی زیر واحد آنزیم برابر 1+-47 کلودالتون تعیین شد. وزن مولکولی آنزیم طبیعی توسط hplc غربالگری ژل روی tsk ژل 3000sw تعیین شد و برابر 5+-275 کیلودالتون بدست آمد. بنابراین احتمالا آنزیم شش زیر واحدی می باشد. همچنین کینتیک آنزیم خالص شده، بررسی شد. بر خلاف nad+، آنزیم هیچگونه فعالیتی در حضور nadp+ نشان نداد، پس آنزیم برای nad+ ویژه است. ph بهینه آنزیم در واکنش تبدیل ال - گلوتاامات، 25/9 و در واکنش بالعکس، 25/8 تعیین گردید. مطالعه پایداری حرارتی آنزیم طی مدت 10 دقیقه نشان داد که آنزیم در 20 تا 37 درجه سانتی گراد پایداری است، حال آنکه سریعا در 55 درجه سانتی گراد غیرفعال می شود. پارامترهای km و vmax آنزیم نیز برای سوبستراهایش تعیین گردید.