همسانه سازی ژن عامل آنزیم تروپینون ردوکتاز ii در باکتری e. coli
چکیده
دو تروپان آلکالوئید هیوسیامین و اسکوپولامین ازمواد مهم دارویی هستند که از گیاهان خانواده سولاناسه از جمله گیاه بنگ دانه(hyoscyamus niger) استخراج می شوند. این تروپان آلکالوئیدها به واسطه تاثیر بر روی سیستم عصبی پاراسمپاتیک در درمان تشنج، سیاه سرفه، سل و برونشیت مزمن مورد استفاده قرار می گیرند. تروپینون پیش ماده واسط در مسیر بیوسنتزی تروپان آلکالوئیدهاست که تروپینون ردوکتاز- i (tr-i) آن را به تولید هیوسیامین و هیوسین و آنزیم تروپینون ردوکتاز - ii (tr-ii) به عنوان آنزیم رقیب عمل کرده و آن را به آلکالوئیدهای غیر تروپانی کالستیژین تبدیل می کند. از روش های مختلفی برای افزایش این تروپان آلکالوئیدها استفاده می شود که استفاده از دست ورزی ژنتیکی غیرقابل انکار می باشد. بدین منظور در این پژوهش ابتدا با استفاده از الیسیتورهای متیل جاسمونات و جاسمونات و iba برای تحریک افزایش بیان ژن عامل tr-ii و نهایتا کلون کردن ژن مذکور در باکتری e. coli و ناقل دوتایی pbi1121 استفاده گردید. بذرهای گیاه بنگ دانه تهیه و پس از جوانه زدن برای تولید ریشه در محیط کشت b5 حاوی 1 میکرومولار در لیتر iba کشت شدند. علاوه براین ریشه ها تحت تیمارهای الیسیتورهای متیل جاسمونات و جاسمونات قرار گرفتند. سپس rna کل از ریشه ها استخراج و cdna ساخته شد. با استفاده از واکنش pcr، تکثیر ژن با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن انجام گرفت. قطعه تکثیرشده و فاژمید pbluescript به باکتری e. coli سویه dh5? تراریخت شدند. در نهایت فاژمید نوترکیب از باکتری استخراج و برای مطالعه درستی همسانه سازی از سه روش هضم آنزیمی، pcr و توالی یابی dna استفاده گردید. پس از تائید، قطعه هدف به ناقل دوتایی pbi121 در جهت آنتی سنس انتقال یافت. نتایج نشان داد که بیان ژن تروپینون ردوکتاز – ii در ریشه های تحت تیمار الیسیتورهای متیل جاسمونات و جاسمونات کاهش یافت. فاژمیدهای نوترکیب با استفاده از روش های هضم آنزیمی، pcr و توالی یابی مورد تائید قرار گرفت. توالی یابی نشان داد که ژن هدف استخراج شده از گیاه بنگ دانه بومی ایران دارای 99% مشابهت با ژن ثبت شده در پایگاه ncbi می باشد. توالی اسید آمینه و جایگاه فعال آنزیم نیز با توالی اسید آمینه و جایگاه فعال آنزیم در پایگاه ncbi نیز 100% مشابهت داشت. سپس قطعه هدف در ناقل دوتایی pbi121 در باکتری e. coli و اگروباکتریوم سویه gv3101 کلون و درستی انجام آن با استفاده از روش های مولکولی مورد تائید قرار گرفت.