تهیه سازه rnai اختصاصی بذر برای ژن های رمزگردان آلفا زئین 19-kda ذرت
چکیده
وجود سازه اختصاصی بذر برای تغییر ژنتیکی پروفایل پروتئین های ذخیره ای دانه ذرت از مهمترین نیازهاست که در این تحقیق هدف گیری شده است. پروتئین های ذخیره ای غالب دانه ذرت، یعنی زئین ها که60% پروتئین های ذخیره ای دانه ذرت را تشکیل می دهند ، از نظر محتوای اسیدآمینه های ضروری مانند لیزین و تریپتوفان دارای کمبود هستند که این امر منجر به کیفیت غذائی پائین دانه ذرت می شود. از طریق شناسایی موتانت ها یا دستکاری های ژنتیکی انجام شده، نشان داده شده است، دانه هایی که میزان پروتئین های زئین آنها کاهش یافته، میزان کل اسیدآمینه های لیزین و تریپتوفان در آنها افزایش پیدا کرده است. زیرخانواده 19-kdaاز کلاس آلفا زئین 40% از کل پروتئین های زئین را تشکیل می دهد و تقریبا بصورت کامل از اسیدآمینه های لیزین و تریپتوفان تهی است. هدف از اجرای این تحقیق تولید سازه پلاسمیدی rnai (rna interference) اختصاصی بذر برای خاموشی ژن های مربوط به زیرخانواده 19-kdaاز کلاس آلفا زئین از طریق فناوری rnai می باشد تا از این طریق موجبات کاهش پروتئین های زئینی فقیر از اسیدآمینه های ضروری و به دنبال آن افزایش پلیوتروپیک پروتئین های غیر زئینی غنی از اسیدآمینه های لیزین فراهم گردد. بمنظور ساخت سازه مورد نظر، رشته همسو و ناهمسو ژن مورد نظر که هر دو تحت تنظیم یک راه انداز اختصاصی آندوسپرم بذر ذرت قرار دارند و توسط یک رشته غیر مشابه جدا می شوند در یک سازه با همدیگر همسانه سازی شدند. برای این کار در ابتدا قطعات مورد نظر شامل قطعه 19pro&s (رشته همسو حاوی راه انداز اختصاصی آندوسپرم بذر) و قطعه 19as (رشته ناهمسو) بوسیله واکنش زنجیره ای پلیمراز تکثیر و پس از تایید اندازه آنها بوسیله الکتروفورز ژل آگارز، بصورت جداگانه در حامل همسانه سازیpgem-t شرکت promega همسانه-سازی شدند. سپس قطعه 19as که تا پیش از این در حامل یاد شده همسانه سازی شده بود با برش توسط آنزیم های برشی sac i و pst i از حامل خارج و پس از استخراج از ژل آگارز بوسیله کیت استخراج از ژل شرکت bioneer، در حامل همسانه سازی حاوی قطعه 19pro&s تهیه شده از قبل و در پایین دست این قطعه و بصورت ناهمسو با آن درج شد. بعد از رونویسی این توالی تشکیل یک مولکول rna دورشته ای سنجاق سری را می دهد که آغازگر فرایند rnai است. در طول ساخت سازه مورد نظر صحت قطعات با استفاده از توالی یابی تایید شدند. آنالیزهای مقایسه ای کاست ساخته شده با نتایج ثبت شده با استفاده از نرم افزارهای بیوانفورماتیکی انجام گرفت.