تولید پروتئین نوترکیب gm-csf در باکتری e. coli
چکیده
فاکتور رشد گرانولوسیتی-مونوسیتی انسانی(gm-csf)، گلیکوپروتیینی با وزن ملکولیkd 477/14 می باشد. ژن gm-csf بر روی کروموزوم شماره 5 انسانی (5q31.1) قرار دارد. این پروتئین باعث تحریک تکثیر و تمایز سلولهای زاینده گرانولوسیت و ماکروفاژ می شود. پروتئین gm-csfانسانی دارای 144 اسید آمینه می باشد که 17 اسید آمینه آن نقش سیگنال پپتید را برای پروتئین ایفا می نمایند. و تعداد 127 اسید آمینه آن به عنوان پروتئین دارویی با نام مولگراموستیم شناخته می شود. gm-csf دارویی است که با تحریک تولید و تکامل سلول های خونی تاًثیر قابل توجهی در احیاء سلولهای خونی دارد. gm-csf توسط سلول های اندوتلیال، منوسیت، فیبروبلاست و سلول های لنفوسیت t تولید می شود. در این مطالعه برای بیان gm-csf از حاملی موسوم به pet-32(b) محصول شرکت novagen استفاده گردید. این حامل ???? جفت باز اندازه دارد و برای کلون نمودن و بیان بالای پروتئین های متصل شده به تیوردوکسین مورد استفاده قرار می گیرد. همچنین پروموتور این حامل از نوع t7 است و دارای توالی های قابل شکست his tag و s tag است. در این تحقیق از سویه باکتریاییrosetta-gami (de3) e.coli به عنوان میزبان استفاده شد و به علت وجود توالی پلی هیستیدین متصل به پروتئین مورد نظرمان از کروماتوگرافی تمایلی نیکل جهت خالص سازی استفاده شد. در مرحله اول، cds ژن gm-csf به صورت سنتتیک ساخته شد و در وکتور pet-32(b) قرار داده شد. پس از انتقال به باکتریrosetta-gami (de3) e.coli، در 4 زمان 2، 4، 6 و 8 ساعت و سه دمای 30، 34 و37 درجه سانتی گراد بهینه سازی بیان پروتئین انجام گرفت. محلول حاصله به وسیله page -sds آنالیز شد. همچنین جهت خالص سازی پروتئین مورد نظر از آنزیمی به نام انتروکیناز استفاده شد که این آنزیم کاملا تخصصی برش در جایگاه توالیasp-asp-asp-asp-lys? ایجاد می کند و در نتیجه پروتئین مورد نظرمان به صورت جدا از پروتئین تیوردوکسین با استفاده از page -sds مشاهده شد نتایج این مطالعه نشان داد که بالاترین غلظت پروتئین gm-csf برابر lµg/µ 9/0 مربوط به دمای 34 درجه سانتی گراد و زمان 4 ساعت بود. در مطالعات قبلی غلظت پروتئین gm-csf بین 3/0 تاlµg/µ 8/0 اندازه گیری شده است که پس از بهینه سازی در این مطالعه غلظت بالاتری نسبت به تحقیقات گذشته مشاهده شد.