بیان پروتئین بیگانه در گیاه با استفاده از حامل ویروس گیاهی
چکیده
به منظور مطالعه ی کاربرد حامل های ویروس گیاهی برای بیان پروتئین بیگانه در گیاه، یک حامل ویروس گیاهی که از همسانه ی آلوده کننده ویروس موزائیک زرد کدو (zymv) به دست آمده بود، برای بیان پروتئین های مختلف با کاربردهای متفاوت استفاده شد. اینترفرون گامای انسانی (inf-?) و پروتئین حرکتی ویروس موزائیک پیسک سبز خیار (cgmmv mp) به منظور بیان و خالص سازی به ترتیب به عنوان ماده موثره دارو و آنتی ژن انتخاب شد. قاب های خواندنی ویروس موزائیک خیار (cmv) به جز رپلیکاز برای تعیین ساز و کار پایداری پروتئین پوششی (cp) آن بیان شد. همچنین، برای بررسی بیان و هدف گیری پروتئین بیگانه به شبکه اندوپلاسمی، ژن گزارشگر gfp استفاده شد. ژن های مورد نظر میان قاب های p1 و hc-pro در حامل zymv قرار داده شد. توانایی آلوده کنندگی حامل نوترکیب با مالیدن پلاسمید روی گیاه سلمه تره و بروز لکه های موضعی تایید شد. سپس یک لکه منفرد برای انتقال مکانیکی ویروس نوترکیب به کدو در مرحله دو برگی استفاده شد. برگ گیاهان مایه زنی شده به وسیله rt-pcr و آزمون لکه گذاری وسترن بررسی شد. روش های کروماتوگرافی ستونی و سانتریفوژ افتراقی به ترتیب برای خالص سازی inf-? و cgmmv mp استفاده شد. نتایج نشان داد که حامل های نوترکیب پس از چند بار انتقال پی در پی و نیز یک دوره 35 روزه پایدار بودند. بر اساس نتایج، inf-? و cgmmv mp دو هفته پس از مایه زنی به ترتیب نزدیک به یک تا 2/1 میلی گرم و 8/1 تا 2/2میلی گرم از هر صد گرم بافت برگ، خالص سازی شد. بیان قاب های خواندنی cmv به تنهایی و در ترکیب با cmv طبیعی نشان داد که cmv cp نوترکیب که توسط zymv بیان شده، علائم را تغییر داد ولی در هیچ کدام از تیمارها به جز در تیمار مایه زنی شده با cmv طبیعی قابل ردیابی نبود. ریزنگاره ی الکترونی همراه نشاندار کردن پیکره ی cmv با طلا نشان داد که cp نوترکیب با اتصال به آر اِن اِی پایدار شد. هدف گیری gfp با استفاده از پپتید نشانه sekdel نشان داد که هدف گیری gfp به شبکه ی اندوپلاسمی میزان بیان پروتئین نوترکیب را به طور قابل توجهی افزایش داد. این سامانه ظرفیت تولید پروتئین های دیگر مورد نظر در کدوئیان را دارد که برای اهداف تولید آتی ژن، کاربردهای دارویی، مطالعه ی عملکرد ژن و سایر موارد کاربرد دارد.